Главная > Электродвигатели > Анаболизм и катаболизм микробиология. Курсовая работа: Энергетический метаболизм микроорганизмов


Анаболизм и катаболизм микробиология. Курсовая работа: Энергетический метаболизм микроорганизмов




Окислительный метаболизм. Бактерии, об­ладающие окислительным метаболизмом, энергию получают путем дыхания.

Дыхание - процесс получения энергии в реакциях окисления-восстановления, сопряженных с реакциями окислительного фосфорилирования, при котором донора­ми электронов могут быть органические (у органотрофов) и неорганические (у литотрофов) соединения, а акцептором - только неорганические соединения.
У бактерий, обладающих окислительным ме­таболизмом, акцептором электронов (или водорода (Н +)) является молекулярный кислород. В этом случае пируват полностью окисляется в цикле трикарбоновых кислот до С 2 . Цикл трикарбоновых кислот выполняет функции как поставщика предшественников для биосинтетических процессов, так и атомов водорода, который в форме восстановленного НАД пе­реносится на молекулярный кислород через серию переносчиков, обладающих сложной структурно оформленной мультиферментной системой - дыхательной цепью. Дыхательная цепь у бактерий локализована в ЦПМ и во внут­риклеточных мембранных структурах.
Переносчики, осуществляющие транспорт водорода (электронов) на молекулярный кислород, относятся к 4 классам дегидрогеназ, коферментами которых являются НАД, флавопротеины, хиноны и цитохромы. Протоны (электроны) передвигаются от одного носителя к другому в направлении увеличивающегося окислительно-восстановительного потенциала. Типичная цепь выглядит следующим образом:

ЦТК -> НАД(Н 2) -> флавопротеид -> хинон ---> цитохромы: в -> с --> а - O 2

Среди бактериальных цитохромов различа­ют цитохромы в, с, а и а 3 . Конечным этапом переноса электронов (протонов) по дыхательной цепи является восстановление цитохромов а - а3 (цитохромоксидазы). Цитохромоксидаза является конечной оксидазой, передающей электроны на кислород. В процессе переноса электронов по цитохромам меняется валентность входящего в состав железопорфирированной группы железа. Завершается перенос электронов реакцией O 2 + 4F 2+ 2О 2 + 4F 3+ . Образующиеся при окислении ФАД или хинонов протоны связываются ионами О 2 " с образованием воды.

Образование АТФ вдыхательной цепи связы­вают с хемоосмотическим процессом. Особая ориентация переносчиков в ЦПМ приводит к тому, что передача водорода происходит с внутренней на внешнюю поверхность мем­браны, в результате чего создается градиент атомов водорода, проявляющийся в наличии мембранного потенциала. Энергия мембранного потенциала используется для синтеза ло­кализованной в мембране АТФазой АТФ.

В это время у эукариотов ферменты дыха­тельной цепи имеют относительно постоян­ный состав, у бактерий встречаются вариации в составе дыхательной цепи. Так, у многих бактерий вместо убихинонов имеются нафтохиноны, состав цитохромов может зависеть от условий роста бактерий. У некоторых бакте­рий цитохромы отсутствуют, и при контакте с кислородом происходит непосредственный перенос водорода на кислород с помощью флавопротеидов, конечным продуктом при этом оказывается перекись водорода - Н 2 О 2 .

Помимо углеводов прокариоты способны использовать другие органические соедине­ния, в частности белки, в качестве источника энергии, окисляя их полностью до СО 2 и Н 2 О.

Аминокислоты и белки также могут высту­пать в качестве энергетических ресурсов. Их использование связано, в первую очередь, с определенными ферментативными преобразованиями подготовительного характера. Белки вначале вне клетки расщепляются протеолитическими ферментами на пептиды, ко­торые поглощаются клеткой и расщепляются внутриклеточными пептидазами до амино­кислот. Аминокислоты могут использоваться в конструктивном метаболизме, а могут у ам­монифицирующих бактерий служить основ­ным материалом в энергетических процессах при окислительном дезаминировании, в резуль­тате которого происходит выделение аммиака и превращение аминокислоты в кетокислоту, которая через цикл трикарбоновых кислот вступает в конструктивный метаболизм:

2R-CHNH 2 -СООН + O 2 -> 2R-СО-COOH + 2NH 3

Процесс аммонификации известен как «гниение», при этом происходит накопление продуктов, обладающих неприятным специ­фическим запахом образующихся при этом первичных аминов.

Гнилостные бактерии осуществляют мине­рализацию белка, разлагая его до СО 2 , NH 3 , H 2 S. К гнилостным бактериям относятся Proteus, Pseudomonas, Bacillus cereus.

Бродильный (ферментативный) метаболизм.

Ферментация, или брожение, - процесс получения энергии, при котором отщеплен­ный от субстрата водород переносится на органические соединения.

Кислород в процессе брожения участия не принимает. Восстановленные органические соединения выделяются в питательную среду и накапливаются в ней. Ферментироваться могут углеводы, аминокислоты (за исключе­нием ароматических), пурины, пиримидины, многоатомные спирты. Не способны сбра­живаться ароматические углеводороды, стероиды, каротиноиды, жирные кислоты. Эти вещества разлагаются и окисляются только в присутствии кислорода, в анаэробных усло­виях они стабильны. Продуктами брожения являются кислоты, газы, спирты.

При ферментации гексоз (глюкозы) пируват лишь частично окисляется в цикле трикарбоновых кислот. Последний выпол­няет только функции поставщика предшественников для биосинтетических процессов. Энергия в форме 2 молекул АТФ образуется в результате субстратного фосфорилирования, протекающего при окислении триозофосфата в пируват. Отщепившийся от субстра­та водород, находящийся в форме восста­новленного НАД, переносится на пируват, превращая его в цепи реакций в этанол, кислоты, газы. Исходя из природы конечных продуктов, различают несколько типов ферментации углеводов.

Спиртовое брожение. Встречается, в основ­ном, у дрожжей. Конечными продуктами яв­ляются этанол и СО 2 . Сбраживание глюко­зы происходит по ФДФ-пути в анаэробных условиях. При доступе кислорода процесс брожения ослабевает, на смену ему приходит дыхание. Подавление спиртового брожения кислородом называется эффектом Пастера.

Спиртовое брожение используется в пищевой промышленности: хлебопекарной, виноделии.

Молочнокислое брожение. Различают два ти­па молочнокислого брожения: гомоферментативное и гетероферментативное.

При гомоферментативном типе расщеп­ление глюкозы проходит по ФДФ-пути. Водород от восстановленного НАД переда­ется на пируват при помощи лактатдегидрогеназы, при этом образуется молочная кислота. Гомоферментативное молочно­кислое брожение происходит у S. pyogenes, E.faecalis, S. salivarius у некоторых видов рода Lactobacillus: L. dulgaricus, L. lactis.

Гетероферментативное молочнокислое бро­жение присутствует у бактерий, у которых от­сутствуют ферменты ФДФ-пути: альдолаза и триозофосфатизомераза. Расщепление глю­козы происходит по ПФ-пути с образовани­ем фосфоглицеринового альдегида, который превращается далее в пируват по ФДФ-пути ив последующем восстанавливается в лактат. Дополнительными продуктами этого типа бро­жения являются также этанол, уксусная кисло­та. Гетероферментативное молочнокислое бро­жение встречается у различных представителей бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium.

Продукты молочнокислого брожения игра­ют большую роль в формировании колонизационной резистентности бактериями рода Lactobacillus и Bifidobacterium, составляющих облигатную флору кишечника.

Молочнокислые бактерии широко исполь­зуются в молочной промышленности для получения молочнокислых продуктов, а также в создании пробиотиков.

Муравьинокислое (смешанное) броже­ние. Встречается у представителей семейств Enterobacteriaceae Vibrionaceae. Глюкоза рас­щепляется по ФДФ-пути, глюконат расщепляется по КДФГ-пути.

В зависимости от продуктов брожения, вы­деляющихся в анаэробных условиях, различа­ют два типа процессов:
1. В одном случае происходит расщепление пирувата с образованием ацетилкофермента А и муравьиной кислоты, которая, в свою очередь, может расщепляться на двуокись углерода и молекулярный водород. Другими продуктами брожения, образующимися через цепь реакций, являются этанол, янтарная и молочная кислоты. Сильное кислотообразование можно выявить реакцией с индикато­ром метил-рот, который меняет окраску в сильно кислой среде.
2. При другом типе брожения образуется це­лый ряд кислот, однако главным продуктом брожения являются ацетоин и 2,3-бутандиол. Ацетоин образуется из двух молекул пирувата с последующим двукратным декарбоксилированием. При последующем восстановлении ацетоина образуется 2,3-бутандиол. Эти вещества при взаимодействии аl-нафтол в щелочной среде вызывают образование окраски бурого цвета, что выявляется реакцией Фогеса-Проскауэра, используемой при идентификации бактерий.

Маслянокислое брожение. Масляная кислота, бутанол, ацетон, изопропанол и ряд других ор­ганических кислот, в частности уксусная, капро­новая, валерьяновая, пальмитиновая, являются продуктами сбраживания углеводов сахароли-тическими строгими анаэробами. Спектр этих кислот, определяемый при помощи газожид­костной хроматографии, используется как экс­пресс-метод при идентификации анаэробов.

Ферментация белков. Если для бактерий с бродильным метаболизмом источником энергии служат белки, то такие бактерии называ­ются пептолитическими. Пептолитическими являются некоторые клостридии, в частности С. histolyticum, С. botulinum. Пептолитические бактерии гидролизуют белки и сбраживают аминокислоты. Многие аминокислоты сбра­живаются совместно с другими, при этом од­на выполняет функцию донора, а другая фун­кцию - акцептора водорода. Аминокислота-донор дезаминируется в кетокислоту, которая в результате окислительного декарбоксилирования превращается в жирную кислоту.
5 классификация бактерий по отношению к кислороду. Особенности культивирования анаэробов.

Кислород, широко распространенный в при­роде, находится в свободном и связанном состоянии. В клетках он находится в связанном состоянии в составе воды и органических со­единений. В атмосфере он присутствует в сво­бодном состоянии в виде молекулярной фор­мы, объемная доля которого составляет 21 %.

По отношению к кислороду, а также по использованию его в процессах получения энергии микроорганизмы подразделяются на 3 группы: облигатные аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы.

Облигатные аэробы.
Растут и размножаются только в присутствии кислорода. Используют кислород для получе­ния энергии путем кислородного дыхания.

Энергию получают оксидативным метабо­лизмом, используя кислород как терминаль­ный акцептор электронов в реакции, катали­зируемой цитохромоксидазой.

Облигатные аэробы подразделяются на строгие аэробы, которые растут при парци­альном давлении атмосферы воздуха, и микроаэрофилы, которые, используя кислород в процессах получения энергии, растут при его пониженном парциальном давлении.

Это связано с тем, что у микроаэрофилов имеются ферменты, которые инактивируются при контакте с сильными окислителями и активны только при низких значениях парциального давления кислорода, например, фер­мент гидрогеназа.

Облигатные анаэробы.
Не используют кислород для получения энергии.
Тип метаболизма у них - бродильный, за исключением метаболизма у двух видов бактерий: Desulfovibrio и Desulfotomaculum, которые относятся к хемолитотрофам и обладают сульфатным дыханием. Облигатные анаэробы подразделяются на две группы: строгие анаэробы и аэротолерантные.

Строгие анаэробы характеризуются тем, что молекулярный кислород для них токси­чен: он убивает микроорганизмы или огра­ничивает их рост.

Энергию строгие анаэробы получают маслянокислым брожением. К строгим анаэро­бам относятся, например, некоторые клостридии (С. botulinum, С, tetani), бактероиды.

Аэротолерантные микроорганизмы не ис­пользуют кислород для получения энергии, но могут существовать в его атмосфере.

К этой группе относятся молочнокислые бактерии, получающие энергию гетероферментативным молочнокислым брожением.

Методы культивирования анаэробов.
Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, соз­дать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и био­логических методов.

Физические методы. Основаны на выращивании мик­роорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:
1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;
2) посевом микроорганизмов в глубину плотных пи­тательных сред;
3) механическим удалением воздуха из сосудов, в ко­торых выращиваются анаэробные микроорганизмы;
4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индиффе­рентным газом.

В качестве редуцирующих веществ обычно использу­ют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кис­лород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содер­жание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и зали­вают сверху небольшим количеством стерильного вазе­линового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.

В качестве легко окисляемых веществ используют глю­козу, лактозу и муравьинокислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующи­ми веществами является среда Китта - Тароцци, кото­рая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэ­робов.

Посев микроорганизмов в глубину плотных сред про­изводят по способу Виньяль - Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диа­метром 3-6 мм. Один конец трубки вытягивают в ка­пилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль - Вейона. Капилляр­ный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выде­ления отдельной колонии трубку надрезают напильни­ком, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ло­мают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальней­шего выращивания и изучения в чистом виде.

Удаление воздуха производят путем его механическо­го откачивания из специальных приборов - анаэростатов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостен­ный металлический цилиндр с хорошо притертой крыш­кой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

Замену воздуха индифферентным газом (азотом, во­дородом, аргоном, углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы. Основаны на поглощении кисло­рода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na 2 S2О 4 .
Биологические методы. Основаны на совместном вы­ращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шири­ной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засе­вают аэроб, например, часто используют S.aureus или Serratiamarcescens. На другую сторону засевают ана­эроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размно­жаться аэробы. После того, как весь кислород в прост­ранстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 сут). В целях сокращения воздуш­ного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.
Комбинированные методы. Основаны на сочетании фи­зических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

6 ферменты бактерий. Их классификация. Ферментативная активность микробов и ее использование для идентификации бактерий.
 В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 клас­сам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Ферменты, образу­емые бактериальной клеткой, могут локали­зоваться как внутри клетки - эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду - экзоферменты. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь ис­точниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепля­ют крупные молекулы пептидов, полисаха­ридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализо­ваны в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в про­цессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и - в некоторых слу­чаях - для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности поль­зуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзофермен­тов можно определить при помощи диффе­ренциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.

Идентификация бактерий по фер­ментативной активности.

Наиболее ча­сто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз, используя специальные методы и среды.

Для определения протеолитической активности мик­роорганизмы засевают в столбик желатина уколом. Че­рез 3-5 дней посевы просматривают и отмечают харак­тер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты - индол, сероводород, аммиак. Для их опреде­ления служат специальные индикаторные бумажки, ко­торые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разло­жения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку.

Для многих микроорганизмов таксономическим при­знаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продук­тов . Для выявления этого используют среды Гисса, со­держащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, маль­тозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2-6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».

Для обнаружения газообра­зования в жидкие среды опускают поплавки или исполь­зуют полужидкие среды с 0,5% агара.

Для того чтобы оп­ределить интенсивное кислотообразование , характерное для брожения смешанного типа, в среду с 1% глюкозы и 0,5% пептона (среда Кларка) добавляют индикатор метиловый красный, который имеет желтый цвет при рН 4,5 и выше, и красный -при более низких значениях рН.

Гидролиз мочевины определяют по выделению ам­миака (лакмусовая бумажка) и подщелачиванию среды.

При идентификации многих микроорганизмов исполь­зуют реакцию Фогеса - Проскауэра на ацетоин - проме­жуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты. Положительная реакция свиде­тельствует о наличии бутандиолового брожения.

Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешива­ния микробных клеток с 1 % раствором перекиси водоро­да.

Для определения цитохромоксидазы применяют ре­активы: 1) 1% спиртовый раствор сс-нафтола-1; 2) 1% водный раствор N-диметил-р-фенилендиамина дигидрохлорида. О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появ­ляющемуся через 2-5 мин.

Для определения нитритов используют реак­тив Грисса: По­явление красного окрашивания свидетельствует о нали­чии нитритов.

7 рост и размножение бактерий. Температурные границы роста. Фазы размножения бактерий на жидких питательных средах.
Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом - фор­мированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, атакже размноже­нием - самовоспроизведением, приводящим к увеличению ко­личества бактериальных клеток в популяции.
Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут раз­множаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные - путем перетяжки, в результате образования гантелевидных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.
Делению клеток предшествует репликация бактериальной хро­мосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается, и каждая нить достраивается комплементарной ни­тью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра - нуклеоида.
Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элон­гация, или рост цепи, и терминация.
Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру - периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура - непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов :
1. лаг-фаза;
2. фаза логарифмического роста;
3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрации бактерий;
4. фаза гибели бактерий.
Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кри­вой размножения бактерий, отражающей зависимость логариф­ма числа живых клеток от времени их культивирования.

Лаг-фаза - период между по­севом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4-5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в раз­мерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеино­вых кислот, белка и других компонентов.
Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом ин­тенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5- 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20-40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ра­нимы, что объясняется высокой чувствительностью компонен­тов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.
Затем наступает фаза стационарного роста , при которой количество жиз­неспособных клеток остается без изменений, составляя макси­мальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность вы­ражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования.
Завершает процесс роста бактерий фаза гибели , характеризующаяся отмиранием бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжи­тельность её колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интен­сивность роста и размножения бактерий зависит от многих факторов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.
Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолирован­ные колонии округлой формы с ровными или неровными кра­ями (S- и R-формы), различной консистенции и цве­та, зависящего от пигмента бактерий.

Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питатель­ную среду и окрашивают её. Дру­гая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в орга­нических растворителях. И, нако­нец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пиг­менты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины яв­ляются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксидцисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают ан­тимикробным, антибиотикоподобным действием.

8 принципы культивирования бактерий. Методы выделения чистых культур бактерий, цель.
Универсальным инструментом

Посевы «газоном»

Чистой культурой называется популяция бактерий од­ного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты - биовары . Биовары, различающие­ся по биохимическим свойствам, называют хемоварами , по анти­генным свойствам -сероварами , по чувствительности к фагу - фаговарами . Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами , которые обычно обозначаются номерами или какими-либо сим­волами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактерио­логических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами.

Колония представляет собой видимое изолированное скоп­ление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей мор­фологии, цвету и другим признакам.

Чистую культуру бактерий получают для проведения диагно­стических исследований - идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимиче­ских и других признаков микроорганизма.

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.

Культуральные свойства характеризуются питатель­ными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плот­ных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по мор­фологии колоний и особенностям роста культуры.

Биохимические признаки бактерий определяются на­бором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической прак­тике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определя­ют на дифференциально-диагностических средах.

При идентификации бактерий до рода и вида обращают вни­мание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент обра­зуют Serratia marcescens, золотистый пигмент - Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент - Pseu-domonas aeruginosa.

Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выявлению соответствующего маркера – определению фермента, антигена, чувствительности к Фанам.

Методы выделения чистых культур бакте­рий.

Универсальным инструментом для производства посевов явля­ется бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом при­меняют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри - металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пасте­ровские и градуированные пипетки. Первые предварительно из­готовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец ка­пилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец за­крывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая дру­гими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной ма­териал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней ча­сти среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надписывают, указывая дату посева и характер посевного мате­риала (номер исследования или название культуры).

Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, пет­лей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горел­ки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

  • Модуль 2. Понятие метаболизма, гомеостаза, физиологической адаптации человека.
  • Морфо-функциональная характеристика нейрона (сомы, дендритов, аксона, аксонного транспорта, метаболизма). Типы нервных клеток. Функциональная классификация нейронов.

    • Несмотря на то что органическая жизнь в целом очень сложное и многогранное явление, отдельные механизмы, поддерживающие ее существование, могут быть разобраны до совершенно простых составляющих, которые доступны для понимания даже неофитам, впервые заинтересовавшимся вопросами микробиологии. К таким условно сложным, но на самом деле очень простым механизмам относится и метаболизм бактерий.

    Общая картина

    В микробиологии общая картина метаболизма в любом организме представляет собой цикл реакций, одни из которых обеспечивают организм энергией, а другие постоянно пополняют организм материей (поставляют строительный материал).

    Метаболизм бактериальной клетки в этом плане ничем не отличается от общих биологических начал. Более того, бактерии были основоположниками функционирующего и ныне механизма обеспечения жизнедеятельности живой клетки.

    В зависимости от продуктов метаболизма выделяется два его вида:

    1. Энергетический катаболизм или реакция разрушения. Фактически этот вид метаболизма обеспечивается за счет окислительного дыхания. В процессе дыхания организуется приток в организм элементов-окислителей, окисляющих уже присутствующие в этом организме определенные химические соединения с выделением энергии АТФ. Эта энергия присутствует в клетке в виде фосфатных связей.
    2. Конструктивный анаболизм или реакции созидания. Это процесс биосинтеза органических молекул, которые необходимы для поддержания жизни в клетке. Протекает в виде химических реакций, в которые вступают поступающие в клетку вещества и собственные внутриклеточные продукты катаболизма (амфиболиты). Эти реакции обеспечиваются энергией за счет потребления накопленного в АТФ энергетического запаса.

    Наличие строгой градации не подразумевает того, что где-то в организме бактериальной клетки отдельно синтезируется энергия, а отдельно строится органическая материя с потреблением уже наработанной энергии. Нет.

    Подавляющее большинство метаболических процессов протекают в прокариотической клетке одновременно и представляют собой замкнутый цикл. Так, в процессе катаболизма образуются продукты, которые сразу же подхватываются клеточными структурами, и запускается реакция биосинтеза определенных ферментов, которые, в свою очередь, регулируют процессы энергетического синтеза.

    По отношению к субстрату метаболизм у бактерий делится на несколько этапов:

    1. Периферический – обработка субстрата ферментами, выработанными бактерией.
    2. Промежуточный – синтез в клетке промежуточных продуктов.
    3. Заключительный – выделение конечных продуктов в окружающую среду.

    Эти этапы важны для идентификации микробиологами прокариотов по тем ферментам, которые они вырабатывают на разных стадиях метаболизма.

    Особенности метаболизма бактерий состоят в том, что прокариотические клетки в качестве окислителей (источников энергии и углерода) могут использовать не только кислород, а и другие органические и неорганические соединения. Из присутствующей на планете Земля органики только бактерии имеют такой широкий доступ к исходным ресурсам для поддержания своей жизнедеятельности.

    Такие особенности метаболизма у бактерий обусловлены наличием двух видов ферментов (белковых молекул, ускоряющих реакции в живых клетках):

    • экзоферменты – белковые молекулы, которые клетка продуцирует наружу и которые разрушают наружный субстрат до исходных молекул (именно эти молекулы уже могут поступать через клеточную стенку в цитоплазму);
    • эндоферменты – белковые молекулы, действующие внутри клетки и вступающие в реакцию с молекулами субстрата, поступившими извне.

    Некоторые ферменты вырабатываются клеточным организмом постоянно (конститутивные), а есть и такие, которые вырабатываются как реакция на появление того или иного субстрата (индуцибельные).

    Энергетический метаболизм (дыхание)

    Энергетический метаболизм у представителей царства бактерий может осуществляться двумя разными биологическими путями:

    • хемотрофный (получение энергии в результате протекания химических реакций);
    • фототрофный (энергия фотосинтеза).

    Хемотрофное дыхание (перенос электрона с субстрата на внутриклеточные вещества) у бактерий происходит тремя способами:

    • кислородное окисление (аэробное дыхание);
    • бескислородное (анаэробное дыхание);
    • брожение.

    К особенностям метаболизма у бактерий относится присущее только миру прокариотов богатство выбора приемщиков свободного электрона, который высвобождается в процессе окисления субстрата.

    Так, в зависимости от того, какое вещество является конечным акцептором электронов, различаются такие виды анаэробного дыхания:

    • сульфатное (электрон переходит на сульфатную группу SO4);
    • нитратное (электрон переходит на группы NO3 или NO2);
    • карбонатное или метаногенное (СО2);
    • фумаратное (фумаровая кислота) – это единственная реакция, когда в качестве приемщика электрона выступает органическое соединение. Чаще всего такой тип дыхания является дополнительным в бактериальных клетках и может существовать наряду с другими типами энергетического метаболизма у бактерий.

    Конструктивный анаболизм (сборка органики)

    Использование энергии АТФ для построения клеточного материала является не чем иным, как реакциями биосинтеза по созданию:

    • аминокислот;
    • нуклеотидов;
    • липидов;
    • углеводов.

    Реакции протекают в несколько этапов. В результате начальных стадий из продуктов разложения глюкозы (пентозофосфаты, пирувата, ацетила КоА и т.д.) образуются белковые молекулы-мономеры, которые на следующих этапах собираются в макромолекулы.

    Синтез аминокислот

    Аминокислоты – основной строительный материал для белка. В состав белка входят 20 аминокислот, и все они синтезируются самой бактерией. Этот синтез происходит в результате 7 основных биосинтетических реакций:

    • преобразование пировиноградной кислоты;
    • карбоксилирование щавелевоуксусной кислоты;
    • преобразование α-Кетоглутаровой кислоты;
    • гликолиз 3-Фосфоглицериновой кислоты;
    • преобразование Фосфоенолпировиноградной кислоты+эритрозо-4-фосфат;
    • преобразование 5-Фосфорибозил – 1- пирофосфат _ АТФ.

    Аминная группа аминокислот получает свой азот из нитратов, нитритов, молекулярного азота и аммиака (в зависимости от вида бактерий). Именно в эти органические соединения преобразуется неорганический азот, перед тем как стать частью полимерных макромолекул той или иной аминокислоты.

    Синтез нуклеотидов и липидов

    Нуклеотиды – строительный материал для ДНК и РНК, а также для коферментов (небелковых молекул, являющихся активационными центрами белка).

    Если у бактерии есть доступ к остаткам нуклеиновых кислот или нуклеотиды присутствуют в субстрате, бактериальная клетка будет потреблять готовые нуклеотиды, и только при отсутствии готового продукта бактерия осуществляет сложный синтез нуклеинового полимера.

    Липиды – органические вещества, состоящие из жиров и жироподобных веществ, синтезируются бактериями из промежуточного метаболита ацетил-КоА. В результате сложных реакций с использованием ферментов синтезируются жирные кислоты, из которых бактерия строит клеточные стенки и формирует цепи электронного транспорта.

    Все реакции жизнеобеспечения, происходящие в микробной клетке и катализируемые ферментами, составляют обмен веществ, или метаболизм. Промежуточные или конечные продукты, образующиеся в соответствующей последовательности ферментативных реакций, в результате которых разрушается или синтезируется ковалентно связанный скелет конкретной биомолекулы, называют метаболитами.

    В метаболизме микроорганизмов непрерывно осуществляются два противоположных и вместе с тем единых процесса: анаболизм и катаболизм. Другими словами, обмен конструктивный и энергетический. В первом случае обмен веществ протекает с поглощением свободной энергии при расходовании сравнительно небольшого объема питательного материала, во втором — идет процесс выделения свободной энергии, на что расходуется огромная масса питательного субстрата.

    По типу питания живые существа делятся на две группы: голозойные и голофитные. Голозойный тип питания характерен для животных (от высших до простейших). Микробы относятся к голофитному типу питания. Они не имеют органов для принятия пищи, и питательные вещества у них проникают через всю поверхность тела.

    Различают несколько механизмов питания микробных клеток. Питательные вещества могут поступать из внешней среды в микробную клетку через клеточную стенку, капсулу, слизистые слои и цитоплазматическую мембрану. Через эти же структуры выделяются и продукты обмена, т. е. ненужные и вредные для микроорганизмов вещества. В основе механизма такого питания лежит осмотическое явление, основанное на разнице концентрации питательных веществ в теле микроба и питательном растворе. Таким образом вода и растворенные в ней питательные вещества поступают в микробную клетку. В результате биосинтеза в ней накапливается пластический материал коллоидной структуры (белки, углеводы и др. вещества), обусловливающий рост и размножение микроорганизма.

    Проникновение питательных веществ в клетку может осуществляться с помощью диффузии и стереохимического специфического переноса питательных веществ. Каждый из этих процессов может протекать как активно, так и пассивно. При пассивной диффузии питательные вещества проникают с током жидкости в клетку и только тогда, когда проникаемое вещество способно растворяться в клеточной стенке бактериальной клетки. При активной диффузии наблюдается проникновение питательных веществ в бактериальную клетку нерастворенными в клеточной стенке.

    При стереохимическом переносе питательных веществ (из внешней среды в клетку) роль переносчика выполняет пермеаза — белковый компонент. В этот период питательные вещества среды активно транспортируются в клетку, осуществляя конструктивный и энергетический обмены.

    В норме у бактериальных клеток всегда наблюдается определенное напряжение цитоплазмы. Это объясняется тем, что коллоиды цитоплазмы благодаря постоянному притоку к клетке воды находятся в набухшем состоянии, в результате чего цитоплазма бывает плотно прижата к оболочке. Такое явление получило название тургора бактерийной клетки. Тургор определяет постоянство бактерий. Величина осмотического давления у бактерий при этом не превышает 6х10 Па. Но есть микробы, обитающие в морях и океанах, у которых осмотическое давление достигает порядка 9х10 Па.

    Когда бактерии помещают в раствор, содержащий 15—20 % хлорида натрия или сахара (гипертонический раствор), наступает резкое обезвоживание бактерийной клетки и протоплазматическое содержимое ее отходит от оболочки. Такое явление носит название плазмолиза.

    Морфологически плазмолиз характеризуется возникновением шарообразных светопреломляющих образований в теле клетки. У различных микроорганизмов плазмолиз проявляется не в одинаковой степени. К нему особенно устойчивы сенная бацилла, стафилококки, сардины; легко подвергаются плазмолизу бактерии из группы пастерелл, эшерихий, сибиреязвенная бацилла, холерный вибрион и др.

    Противоположный плазмолизу процесс — плазмоптиз — наблюдается в том случае, если бактерии поместить в гипотонический раствор хлорида натрия или в дистиллированную воду. Вода проникает при этом в бактерийную клетку, цитоплазматическое вещество ее разбухает до крайних пределов, и клетка приобретает форму шара. Плазмоптиз, так же как и плазмолиз, влечет за собой гибель бактерийной клетки.

    Типы питания микробов. Различают углеродное и азотное питание микроорганизмов. По типу углеродного питания микробы принято делить на аутотрофы и гетеротрофы.

    Аутотрофы, или прототрофы, (греч. autos — сам, trophe — пища) — микроорганизмы, способные воспринимать углерод из угольной кислоты (СО2) воздуха. К ним относят нитрифицирующие бактерии, железобактерии, серобактерии и др. Аутотрофы превращают воспринятую углекислоту в сложные органические соединения путем хемосинтеза, т. е. путем окисления химических соединений (аммиак, нитриты, сероводород и др.). Таким образом, аутотрофные микробы обладают способностью создавать органические вещества из неорганических, таких как угольная кислота, аммиак, нитриты, сероводород и др. Поскольку такие микробы не нуждаются в органических соединениях углерода, входящего в состав животных и человека, они не являются болезнетворными. Однако среди аутотрофов встречаются микробы, обладающие способностью усваивать углерод из СО2 воздуха и из органических соединений. Такие микробы определены как миксотрофы (миксо — смесь, т. с. смешанный тип питания). Отдельные виды аутотрофных микробов питание осуществляют подобно зеленым растениям за счет фотосинтеза. Так, пурпурные серобактерии вырабатывают особый пигмент типа хлорофилла — бактериопурпурин, при помощи которого и происходит использование световой энергии (фотосинтез) для построения органических веществ своего тела из угольной кислоты и неорганических солей.

    Гетеротрофы (heteros — другой) в противоположность аутотрофным микробам получают углерод главным образом из готовых органических соединений. Гетеротрофы — возбудители различного рода брожений, гнилостные микробы, а также все болезнетворные микроорганизмы: возбудители туберкулеза, бруцеллеза, листсриоза, сальмонеллеза, гноеродные микроорганизмы — стафилококки, стрептококки, диплококки и ряд других патогенных для животного организма возбудителей.

    Однако все физиологическое многообразие микроорганизмов не укладывается в узкое понятие об аутотрофах и гетеротрофах. В действительности же при изменении условий среды (например, питания) обмен веществ у микробов может меняться. Если микроб поместить в другую, необычную для него, питательную среду, то он начнет вырабатывать адаптивные (приспособительные) ферменты (энзимы). В качестве примера можно указать на азотфиксирующие бактерии (аутотрофы), которые на богатых белковых питательных средах перестают использовать молекулярный азот воздуха и начинают усваивать связанный азот (гетеротрофный тип усвоения азота).

    В качестве источника углерода гетеротрофы чаще всего используют углеводы, спирты, различные органические кислоты. Наиболее полноценными источниками углерода для питания этих микробов являются сахара (особенно гексозы), многоатомные спирты (глицерин, маннит, сорбит и др.), а также карбоновые кислоты (например, глюкуроновая) и оксикислоты (молочная, яблочная и др.). Все эти источники углерода обычно и включают в состав искусственных питательных сред для выращивания микроорганизмов.

    По способу усвоения азотистых веществ микробы делят на четыре группы:

    1) протеолитические, способные расщеплять нативные белки, пептиды и аминокислоты;

    2) дезаминирующие, способные разлагать только отдельные аминокислоты, но не белковые вещества;

    3) нитритно-нитратные, усваивающие окисленные формы азота;

    4) азотфиксирующие, обладающие свойством питаться атмосферным азотом.

    В качестве универсального источника азота и углерода в питательных средах для патогенных микробов применяют пептоны. Потребность микроорганизмов в зольных элементах незначительна. Необходимые для их жизни минеральные соли (сера, фосфор и др.) почти всегда имеются в естественной питательной среде. Сера воспринимается бактериями в основном из сульфатов или органических соединений аминокислот (цистин, цистеин). Серобактерии, например, могут сами ассимилировать даже молекулярную среду. В их теле находится до 80 % серы. Фосфор входит в состав нуклеопротеидов и фосфолипидов бактерийной клетки и играет весьма важную роль в ее биосинтетических процессах. Источником питания фосфором являются различные фосфорнокислые соли, например тринатрийфосфат (ЫазРО4).

    Жизненно необходимые элементы — калий, магний и железо — микроорганизмы получают из различных солей. Железо входит в состав гемина (особая органическая группа цитоплазмы) и служит катализатором окислительных реакций. Калий — обязательный элемент в питательной среде, но физиологическое значение его еще полностью не выяснено. Роль кальция в жизни бактерий (за исключением бактерий, участвующих в фиксации азота из воздуха), по-видимому, невелика. Магний активирует различные ферменты бактерий, в частности протеазу. Микроэлементы бор, цинк, марганец, кобальт и др. встречаются в бактериях в ничтожных количествах и служат стимуляторами роста микробов.

    Факторы роста микробов. В 1901 г. Вильдье в дрожжах нашел особое вещество, названное им «биос» — ростовое вещество. В 1904 г. наш соотечественник Никитинский установил такие же стимуляторы роста в культурах плесневых грибов. В дальнейшем подобные вещества были выявлены у патогенных микроорганизмов и простейших. Одновременно было установлено, что у ряда микробов под воздействием ничтожно малых количеств ростовых веществ увеличивается накопление микробной массы и изменяется обмен веществ. Новейшие данные показали, что по химической структуре и физиологическому действию стимуляторы являются подлинными витаминами или витаминоподобными веществами.

    Все изученные бактерии нуждаются в витаминах или ростовых веществах, которые играют главным образом роль катализаторов (ускорителей) биохимических процессов бактерийной клетки. Они же являются структурными единицами при образовании некоторых ферментов. Какие же витамины необходимы микробам? К витаминам, необходимым для развития микробов, относят биотип (витамин Н), витамины группы В: витамин B1 (тиамин), В2 (рибофлавин), В3 (пантотеновая кислота), В4 (холин), В5 (никотинамид), Вб (пиридоксин), В7 (гемин), — витамин К и др.

    Концентрация витаминов в питательной среде выражается в микрограммах (мкг), потребность в них колеблется в пределах 0,05—40 мкг/мл. Избыток витаминов задерживает рост бактерий.

    Кроме витаминов, к факторам роста бактерий относятся пуриновые и пиримидиновыс основания и их производные (аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин и гипоксантин). Например, для гемолитического стрептококка фактором роста является аденин, для золотистого стафилококка — урацил, возбудителя столбняка — аденин или гипоксантин.

    Некоторые микроорганизмы в качестве фактора роста используют аминокислоты, синтезирующиеся самой микробной клеткой или находящиеся в среде в готовом виде.

    Дыхание микробов — это биологический процесс, сопровождаемый окислением или восстановлением различных, преимущественно органических, соединений с последующим выделением энергии в виде аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), необходимой микробам для физиологических нужд.

    Процесс, в котором атомы или молекулы теряют электроны (е~), называется окислением, а обратный процесс — присоединение электронов — восстановлением. Этот процесс можно продемонстрировать примером превращения частично окисленного двухвалентного железа в полностью окисленное трехвалентное железо и обратно по схеме

    Перенос электрона всегда сопровождается высвобождением энергии, которая немедленно утилизируется клеткой с помощью аденозиндифосфата (АДФ) и аденозинтрифосфата (АТФ). Здесь она накапливается и расходуется по мере надобности микробной клеткой на ее нужды.

    Переносчиками водорода в реакциях биологического окисления и восстановления являются главным образом два пиридиновых нуклеотида (коферменты анаэробных дегидрогеназ) — никотина-мидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидадениндинуклеотид-фосфат (НАДФ). Отнимая водород от окисляемого субстрата, они переходят в восстановительную форму (НАД*Нг и НАДФ#Нг) и переносят водород на другой акцептор. НАД*Н2 передает водород главным образом на промежуточные продукты брожения или в дыхательную цепь, а НАДФ’Нг участвует преимущественно в реакциях биосинтеза различных веществ, которые входят в состав клетки микроорганизма.

    Типы биологического окисления. С биохимической точки зрения окисление биологического субстрата микроорганизмами может быть достигнуто по типу прямого окисления и непрямого окисления, или дегидрогенирования.

    Прямое окисление осуществляется с помощью оксидаз путем непосредственного окисления вещества кислородом воздуха или же путем дегидрирования — отнятия от субстрата водорода, точнее, его электрона. Прямое окисление регистрируется у большинства сапрофитных микроорганизмов. Например, Bact. raetanicum, окисляя метан, получает энергию по следующей схеме:

    СН4 + 2О2 — СО2 + 2Н2О + 946 кДж энергии.

    У некоторых микробов, поглощающих кислород, реакции окисления не доходят до получения конечного продукта, т.е. до образования углекислоты. Примером такого неполного окислительного процесса может служить дыхание уксуснокислых бактерий, у которых конечным продуктом окисления этилового спирта является не углекислота, а уксусная кислота:

    СН3СН2ОН + О2 — СНзСООН + Н2О.

    Непрямое окисление путем дегидрогенирования сопровождается одновременным переносом двух электронов, причем от субстрата отщепляются два протона (Н). При ферментативном отщеплении водорода субстрата при помощи дегидрогеназ освобождаются два электрона (энергия) подобно образованию ацетальдегида из этилового спирта.

    Дегидрогеназ у бактерий несколько, они называются по донору водорода (например, алкогольдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа), но большинство их переносит водород на один из двух коферментов — никотинамидадениндинуклеотид (НАД) или никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ+). Оба кофермента легко отделяются от одной дегидрогеназы и связываются с другой дегидрогеназой, переносят водород на другой акцептор. НАД»Н(+Н) переносит водород преимущественно на предшественники брожения или в дыхательную цепь; НАДФ»Н (+Н+) участвует в основном в биосинтезе.

    Аэробное дегидрогенирование происходит в присутствии кислорода, и у таких микробов как, например, бациллы, акцептором водорода является кислород, в результате чего в зависимости от набора ферментов образуется вода или перекись водорода. Для этого у аэробных бактерий имеются цитохромоксидаза и система геминовых ферментов-цитохромов. Облигатные анаэробы каталазу не содержат, чем частично можно объяснить токсичность для них кислорода.

    Анаэробное дегидрогенирование осуществляется в отсутствие молекулярного кислорода. Акцепторами водорода в данном случае являются другие неорганические элементы, например, соли азотной, серной кислот, углекислоты, которые превращаются при этом в более восстановленные соединения (аммиак, метан, сероводород).

    Свойство анаэробов переносить электроны на нитраты, сульфаты и карбонаты обеспечивает в достаточной степени полное окисление органического или неорганического вещества без использования молекулярного кислорода и обусловливает возможность получения ими большего количества энергии, чем при процессе брожения. При анаэробном дыхании выход энергии только на 10 % ниже, чем при аэробном. Микроорганизмы, для которых характерно анаэробное дыхание, имеют набор ферментов цепи переноса электронов, но цитохромоксидаза заменяется нитратредуктазой (в случае использования нитратов) или аденилилсульфатредуктазой (в случае использования сульфатов).

    Классификация микробов по типу дыхания. В 1861 г. Л. Пастер, изучая бродильные свойства микроорганизмов, обнаружил, что отдельные микробы способны размножаться без доступа атмосферного кислорода. Бактерии и грибы, использующие кислород из воздуха, получили название облигатных аэробов, а в условиях его отсутствия — анаэробов. У аэробов конечным акцептором электронов является молекулярный кислород, для анаэробов конечным акцептором электронов являются неорганические соединения, такие как нитраты, сульфаты, карбонаты.

    По типу дыхания микроорганизмы классифицируют на четыре основные группы.

    Облигатные (безусловные) аэробы растут при свободном доступе кислорода, обладают ферментами, позволяющими передать водород от окисляемого субстрата конечному акцептору — кислороду воздуха. К ним относятся уксуснокислые бактерии, возбудители туберкулеза, сибирской язвы и многие другие.

    Микроаэрофильные бактерии развиваются при низкой (до 1 %) концентрации кислорода в окружающей атмосфере. Такие условия благоприятны для актиномицетов, лептоспир, бруцелл.

    Факультативиые анаэробы вегетируются как при доступе кислорода воздуха, так и в отсутствие его. Имеют соответственно два набора ферментов. Это многочисленная группа микроорганизмов, к которой относятся, в частности, энтеробактерии, возбудитель рожи свиней.

    Облигатные (безусловные) анаэробы развиваются при полном отсутствии кислорода в окружающей среде. Анаэробные условия необходимы маслянокислым бактериям, возбудителям столбняка, ботулизма, газовой гангрены, эмфизематозного карбункула, некробактериоза.

    Окислительно-восстановительный потенциал питательной среды. При изготовлении питательных сред учитывают не только рН среды, но и соотношение веществ, отдающих и принимающих электроны. Величину окислительно-восстановительного потенциала обозначают символом гНг — отрицательный логарифм парциального давления газообразного водорода. Он измеряется потенциометром или на универсальном ионометре в mV и обозначается в единицах. Диапазон гН2 от 0 до 42,6 характеризует все степени насыщения раствора Н и Ог. Так, строгие анаэробы растут при низком окислительно-восстановительном потенциале — от 0 до 12 факультативные микроорганизмы — 0 до 20 и аэробы — от 14 до 35. Следовательно он минимальный при насыщении среды водородом и максимальный при насыщении кислородом. Регулируя степень окислительно-восстановительного потенциала, мы создаем благоприятные условия для роста и размножения микроорганизмов.

    Методы создания анаэробиоза. Для выделения анаэробных возбудителей инфекционных болезней создаются анаэробные условия культивирования. Для этого существует несколько методов.

    1. Физический метод. Он заключается в удалении воздуха из эксикатора или анаэростата при помощи масляного воздушного насоса. Жидкие среды перед засевом для удаления из них воздуха кипятят, т. е. проводят так называемое регенерирование среды; для предотвращения контакта жидкой среды с воздухом на ее поверхность наносят слой вазелинового или парафинового масла.

    2. Химический метод. Основан на применении поглотителей кислорода, например, пирогаллола с гидроокисью натрия, калия либо гидросульфита натрия с натрия гидрокарбонатом в соотношении 1:1.

    3. Биологический метод (метод Фортнера). Основан на выращивании анаэробов в присутствии аэробов (например, «чудесной палочки») в одной чашке Петри. Вначале вырастает аэробная культура, а затем по мере поглощения последней кислорода из чашки начинает развиваться анаэробная культура.

    4. Комбинированный метод. Предусматривает использование двух других, скажем, физиологического и химического.

    Нередко удается ослабить или полностью нейтрализовать вредное для бактерий действие кислорода прибавлением к среде восстановителей (аскорбиновой кислоты, тиогликолата, цистеина).

    Энергетический обмен микробов значительно более разнообразен, чем у высших организмов. Очень распространены у микроорганизмов анаэробные превращения веществ по гликолитическому пути, гексозомонофосфатному и пути Энтнера-Дудорова.

    55. Метаболизм бактерий. Хемосинтез. Аэробные и анаэробные бактерии. Полное и неполное окисление. Анаэробное дыхание.

    Метаболизм – совокупность разнообразных ферментативных реакций, происходящих в микробной клетке и направленных на получение энергии и превращение простых химических соединений в более сложные. Метаболизм обеспечивает воспроизводство всего клеточного материала, включая два единых и одновременно противоположных процесса – конструктивный и энергетический обмен.

    Метаболизм протекает в три этапа:

    1.катаболизм – распад органических веществ на более простые фрагменты;

    2.амфиболизм – реакции промежуточного обмена, в результате которых простые вещества превращаются в ряд органических кислот, фосфорных эфиров и пр.;

    3.анаболизм – этап синтеза мономеров и полимеров в клетке.

    Метаболические пути формировались в процессе эволюции.

    Основным свойством бактериального метаболизма является пластичность и высокая интенсивность, обусловленная малыми размерами организмов.

    К метаболическим путям у прокариот относятся брожение, фотосинтез и хемосинтез.

    Хемосинтез – способ питания, при котором источником энергии для синтеза органических веществ служат процессы окисления различных неорганических и неорганических веществ. Хемосинтез часто сравнивают с дыханием, у микроорганизмов дыхание может быть аэробным и анаэробным.

    Анаэробное дыхание – это энергодающий клеточный процесс, в котором конечным акцептором электронов служит окисленное органическое или неорганическое вещество, отличное от кислорода.

    Анаэробное дыхание сопряжено с функционированием электрон-транспортной цепи и является в эволюции энергетических процессов в клетках живых организмов переходным звеном от субстратного фосфорилирования к аэробному дыханию.

    Акцептор электронов

    Восстановленный продукт

    Процесс

    Микроорганизмы, которые осуществляют данный процесс

    «Нитратное дыхание» - диссимиляционная нитратредукция

    Бактерии семейства Enterobacteriaceae , рода Bifidobacteriaceae

    «Нитратное дыхание» - денитрификация

    Pseudomonas , Bacillus

    «Карбонатное дыхание» – метаногенез

    Метаногенные археи

    «Карбонатное дыхание» – ацетогенез

    Гомоацетогенные бактерии (Clostridium , Sporomusa , Acetobacterium , Peptostreptococcus , Eubacterium )

    «Железное дыхание»

    Geobacter

    2 + фумарат

    Сукцинат

    «Фумаратное дыхание»

    Энтеробактерии, вибрионы и пропионовые бактерии

    Большинство аэробных организмов окисляет питательные вещества в процессе дыхания до углекислого газа и воды.

    Поскольку в молекуле СО2 достигается наивысшая степень окисления углерода, процесс называется полным окислением.

    При неполном окислении в качестве продуктов обмена выделяются частично окисленные органические соединения, такие как уксусная, фумаровая, лимонная, яблочная, молочная кислоты. Субстратом в данном случае становятся углеводы и органические спирты.

    Полное окисление может происходить при использовании цикла трикарбоновых кислот с участием дегидрогеназ никотинамиддинуклеотида, флавинамиддинуклеотида и коэнзима ацетилирования

    Этот метаболический путь не только приводит к полному окислению питательных веществ, но играет значительную роль в биосинтетических процессах. В результате поступления протонов на АТФ-регенирирующую систему дыхательной цепи активируется АТФ-синтетеза и образуется АТФ для обеспечения клетки энергией. В дыхательной цепи главная роль отводится ферментам – цитохромам, флавопротеинам и железосерным белкам. В процессе дыхания аэробных микроорганизмов пировино­градная кислота подвергается полному окислению до CO2 и H2O, вступая в сложный цикл превращений (цикл Кребса) с образованием три- и дикарбоновых кислот, последовательно окисляющихся (отщепляется Н2) и декарбоксилирующихся (отщепляется СО2).

    Дыхательная цепь или электрон-транспортная система у прокариот расположена на цитоплазматической мембране (у эукариот – во внутренней мембране митохондрий). Главная функция этой системы – перекачивание протонов, поэтому ее часто называют «протонным насосом».

    Через мембрану протоны транспортируются таким образом, что между внутренней и внешней сторонами мембраны создается электрохимический градиент с положительным потенциалом снаружи и отрицательным внутри. Этот перепад заряда возникает благодаря определенному расположению компонентов дыхательной цепи в мембране и служит движущей силой для процесса регенерации АТФ (или других процессов, требующих затрат энергии).

    Водород восстановленного НАД2Н передается на кофермент (ФАД) флавинового фермента, который восстанавливается в ФАД2Н. С восстановленной флавиновой дегидрогеназы водород передается на цитохром цитохромной системы, при этом атом водорода расщепляется на ион водорода и электрон. Цитохром из окисленной формы превращается в восстановленную. Восстановленный цитохром передает электроны следующему цитохрому и т. д.

    Цитохромы попеременно то восстанавливаются, то окисляются, что связано с изменением валентности железа, содержа­щегося в их простетической группе. Последний цитохром передает электроны цитохромоксидазе, восстанавливая ее кофермент. Завершающей реакцией является окисление восстановленной цитохромоксидазы молекулой кислорода. Кислород за счет передачи ему (с цитохромоксидазы) электронов активируется и приобретает способность соединяться с ионами водорода, в результате чего образуется вода. На этом и заканчивается у аэробов полное окисление исходного органического вещества.

    Освобождающаяся при переносе электронов в дыхательной цепи энергия затрачивается на синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата под воздействием АТФ-синтетазы, локализующейся на мембране. Такой синтез АТФ за счет энергии транспорта электронов через мембрану называется окислительным фосфорилированием.

    В механизме дыхания особо важны следующие три участка:

    *компоненты дыхательной цепи;

    *их оксилительно-восстановительные потенциалы;

    *их взаиморасположение в мембране.

    Компоненты дыхательной цепи – это ферментные белки с относительно прочно связанными низкомолекулярными простетическими группами, погруженные в двойной липидный слой. Важнейшие из них – флавопротеины, железосерные белки, хиноны и цитохромы.

    Флавопротеины – ферменты, содержащие в качестве простетических групп ФАД, выполняют функцию переносчиков водорода.

    Железосерные белки – это оксилительно-восстановительные системы, переносящие электроны. Они содержат атомы железа, связанные с серой цистеина и с неорганической сульфидной серой. Таким образом, Fe-S-центры являются простетическими группами белков. Железосерные белки участвуют также в процессе азотфиксации. Некоторые белки имеют название, связанное с их происхождением или с функциями: ферредоксин, путидаредоксин, рубредоксин, адренодоксин.

    Хиноны – липофильные соединения, локализующиеся в липидной фазе мембраны, способны переносить водород и электроны. Обычно содержатся в мембране в избытке и случат сборщиками водорода, получая его от коферментов, передают цитохромам. У грамотрицательных бактерий содержится убихинон (кофермент Q), у грамположительных – нафтохиноны, в хлоропластах растений – пластохиноны.

    Цитохромы – системы, переносящие только электроны, водород не транспортируют. В качестве простетической группы цитохром содержит гем. Центральный атом железа геминового кольца участвует в переносе электронов, изменяя свою валентность. Цитохромы окрашены и различаются по видам а, а3, в, с, о и т.д.

    Оксилительно-восстановительный потенциал – это количественная мера способности тех или иных соединений или элементов отдавать электроны. Водородный полуэлемент – платинированный или платиновый электрод, погруженный в раствор кислоты и обтекаемый газообразным Н2 при давлении 1,012 бар и рН 0, имеет потенциал, равный нулю.

    Эта величина Е0. Е` – измеряемый потенциал окислительно-восстановительной системы, значение его тем более отрицательно, чем меньше отношение концентрации окисленной формы к концентрации восстановленной формы.

    Уникальной способностью к биолюминесценции обладает несколько групп бактерий. К светящимся бактериям относят грамотрицательные палочковидные морские бактерии, хемоорганотрофные, галофильные, психрофильные, факультативно-анаэробные, свободноживущие или симбиотические, например Photobacterium rhosphoreum и P. leiognathi, живущие в светящихся органах у рыб.

    В аэробных условиях микроорганизмы осуществляют процесс аэробного дыхания и свечения.

    У них имеется обычная дыхательная цепь и работает цикл Кребса.

    Свечение зависит от окисления длинноцепочечного альдегида с 13 – 18 атомами углерода в молекуле.

    Светится возбужденный флавин под действием люциферазы – двухсубъединичного фермента типа монооксигеназы. К свечению способны бактерии родов Photobacterium, Beneckia, Vibrio, Photorhabdus.

    Конструктивный метаболизм направлен на синтез четырех основных типов биополимеров: белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов.

    Ниже показана обобщенная условная схема биосинтеза сложных органических соединений, где выделены следующие основные этапы: образование из простейших неорганических веществ органических предшественников (I), из которых на следующем этапе синтезируются «строительные блоки» (II). В дальнейшем строительные блоки, связываясь друг с другом ковалентными связями, образуют биополимеры (III): Приложения (рис. № 3)

    Представленная схема биосинтетических процессов не отражает всей сложности превращения низкомолекулярных предшественников в строительные блоки с большой молекулярной массой. На самом деле синтез протекает как серия последовательных реакций с образованием разнообразных промежуточных продуктов метаболизма. Кроме того, уровни развития биосинтетических способностей микроорганизмов очень различны. У одних микробов конструктивный метаболизм включает все показанные на схеме этапы, у других ограничен вторым и третьим или только третьим этапом. Именно поэтому микроорганизмы резко отличаются друг от друга по своим пищевым потребностям. Однако элементный состав пищи одинаков для всех живых организмов и должен включать все компоненты, входящие в клеточное вещество: углерод, азот, водород, кислород и др.

    В зависимости от используемых в конструктивном обмене источников углерода микроорганизмы делятся на две группы: автотрофы и гетеротрофы.

    Автотрофы (от греч. «autos» - сам, «trophe» - пища) в качестве единственного источника углерода используют диоксид углерода и из этого простого неорганического соединения-предшественника синтезируют все необходимые биополимеры. Способность к биосинтезу у автотрофов самая высокая.

    Гетеротрофы (от греч. «heteros» - другой) нуждаются в органических источниках углерода. Их пищевые потребности чрезвычайно разнообразны. Одни из них питаются продуктами жизнедеятельности других организмов или используют отмершие растительные и животные ткани. Такие микроорганизмы называются сапрофитами (от греч. «sapros» - гнилой и «phyton» - растение). Число органических соединений, используемых ими в качестве источников углерода, чрезвычайно велико - это углеводы, спирты, органические кислоты, аминокислоты и т. д. Практически любое природное соединение может быть использовано тем или иным видом микроорганизмов в качестве источника питания или энергии.

    Для синтеза клеточных белков микроорганизмам необходим азот. По отношению к источникам азотного питания среди микроорганизмов можно выделить автоаминотрофов и гетероаминотрофов. Первые способны использовать азот неорганический (аммонийный, нитратный, молекулярный) или простейшие формы органического (мочевина) и из этих соединений строить разнообразные белки своего тела. При этом все формы азота сначала переводятся в аммонийную форму. Эта наиболее восстановленная форма азота легко трансформируется в аминогруппу. Гетероаминотрофы нуждаются в органических формах азота - белках и аминокислотах. Некоторым из них требуется полный набор аминокислот, другие создают необходимые белковые соединения из одной - двух аминокислот путем их преобразования.

    Многие гетеротрофные по отношению к углероду микроорганизмы являются автоаминотрофами. К ним относятся я бактерии, участвующие в очистке сточных вод.

    Потребность в кислороде и водороде для конструктивного обмена микроорганизмы удовлетворяют за счет воды и органических питательных веществ. Источниками зольных элементов (P, S, K, Mg, Fe) служат соответствующие минеральные соли. Потребность в этих элементах невелика, но присутствие в среде обязательно. Помимо того, для нормальной жизнедеятельности микробов необходимы микроэлементы – Zn, Co, Cu, Ni и др. Часть их входит в состав естественного питания микробов, часть усваивается ими из минеральных солей.

    Способы получения пищи, т. е. способы питания микроорганизмов, отличаются большим разнообразием. Различают три основных способа питания: голофитное, сапрозойное, голозойное.

    Голофитное питание (от греч. «голо» - целиком, «фит» - растение) совершается по типу фотосинтеза растений. Такое питание присуще только автотрофам. Среди микроорганизмов этот способ свойствен водорослям, окрашенным формам жгутиковых и некоторым бактериям.

    Гетеротрофные микроорганизмы питаются либо твердыми пищевыми частицами, либо поглощают растворенные органические вещества.

    Голозойное питания предопределяет развитие у микроорганизмов специальных органоидов для переваривания пищи, а у некоторых - и для ее захвата. Например, неокрашенные жгутиковые и ресничные инфузории имеют ротовое отверстие, к которому пища подгоняется соответственно жгутиками или ресничками. Наиболее высокоорганизованные инфузории образуют околоротовыми ресничками ток воды в виде воронки, направленной узким концом в рот. Пищевые частицы осаждаются на дне воронки и заглатываются инфузорией. Такие инфузории называют седиментаторами. Амебы питаются путем фагоцитоза.

    Микроорганизмы с голозойным способом питания для конструктивного метаболизма используют главным образом цитоплазму других организмов - бактерий, водорослей и т. д. и имеют специальные органоиды для пищеварения. Пищеварительный процесс у простейших осуществляется в пищеварительных вакуолях.

    Переваривание заключается в гидролитическом расщеплении сложных органических веществ до более простых соединений. При этом углеводы гидролизуются до простых сахаров, белки - до аминокислот, а при гидролизе липидов образуются глицерин и высшие жирные кислоты. Продукты пищеварения всасываются в цитоплазму и подвергаются дальнейшему преобразованию.

    Бактерии, микроскопические грибы, дрожжи не имеют специальных органоидов для захвата пищи, и она поступает в клетку через всю поверхность. Такой способ питания называется сапрозойным.

    Чтобы проникнуть в клетку, питательные вещества должны находится в растворенном состоянии и иметь соответствующий размер молекул. Для многих высокомолекулярных соединений цитоплазматическая мембрана непроницаема, а некоторые из них не могут проникнуть даже через клеточную оболочку. Однако это не означает, что высокомолекулярные соединения не используются микроорганизмами как питательные вещества. Микроорганизмы синтезируют внеклеточные пищеварительные ферменты, гидролизующие сложные соединения. Таким образом, процесс пищеварения, протекающий у простейших в вакуолях, у бактерий осуществляется вне клетки (Приложения рис. 4).

    Размер молекул - не единственный фактор, обусловливающий проникновение питательных веществ в клетку.

    Цитоплазматическая мембрана способна пропускать одни соединения и задерживать другие.

    Известно несколько механизмов переноса веществ через мембрану клетки: простая диффузия, облегченная диффузия и Активный перенос (Приложения рис. 5).

    Простая диффузия - это проникновение молекул вещества в клетку без помощи каких-либо переносчиков.

    В насыщении клетки питательными веществами простая диффузия большого значения не имеет. Однако именно таким путем в клетку поступают молекулы воды. Немаловажную роль в этом процессе играет осмос - диффузия молекул растворителя через полупроницаемую перепонку в направлении более концентрированного раствора.

    Роль полупроницаемой перепонки в клетке выполняет цитоплазматическая мембрана. В клеточном соке растворено огромное количество молекул разнообразных веществ, поэтому клетки микроорганизмов обладают довольно высоким осмотическим давлением. Величина его у многих микробов достигает 0,5-0,8 МПа. В окружающей среде осмотическое давление обычно ниже. Это вызывает приток воды внутрь клетки и создает в ней определенное напряжение называемое тургором.

    При облегченной диффузии растворенные вещества поступают в клетку с участием специальных ферментов-переносчиков, носящих название пермеаз. Они как бы захватывают молекулы растворенных веществ и переносят их к внутренней поверхности мембраны.

    Простая и облегченная диффузия представляет собой варианты пассивного транспорта веществ. Движущей силой переноса веществ в клетку в этом случае служит градиент концентраций по обе стороны мембраны. Однако большинство веществ поступает в клетку против градиента концентрации. В этом случае на такой перенос затрачивается энергия и перенос называется активным. Активный перенос протекает с участием специфических белков, сопряжен с энергетическим обменом клетки и позволяет накапливать в клетке пительные вещества в концентрации во много раз больше, чем концентрация их во внешней среде. Активный перенос - основной механизм поступления питательных веществ в клетки с сапрозойным питанием.